烤烟是我国重要的经济作物，在其种植过程中会产生连作障碍、重金属富集、土壤养分流失、环境污染等问题，不仅制约国民经济的发展，而且对生态可持续及人类健康产生不利影响。寻求一条经济、环保、健康的方法来解决烤烟种植生产中的不利影响是目前探究的主要方向。微生物技术成为烤烟种植生产中常用的解决方案，如：利用微生物制剂来解决农业生产中病虫害。微生物与植物在长期进化适应过程中形成了稳定的微生物群落，为了能进一步开发烤烟相关微生物产品，获得宝贵的具有应用价值的可培养微生物资源显得尤为重要。刘训理等采用纯培养方法分离到大量自生固氮菌、磷细菌、钾细菌等具有生态功能的根际微生物。顾金刚等从烟田根际土中分离到能够对黑胫病具有抗性的微生物，分别属于假单孢菌属(？
在农业耕作方面，选择合适的耕作模式能够缓解烤烟的连作障碍。研究表明：在长期连作和受外界胁迫(低温、高温、干旱等)条件下，会降低烤烟根际细菌的多样性，细菌群落组成单一化[6-7]。采用间作的耕作模式，不仅能够提高土壤微生物群落多样性、增强抗性、缓解连作障碍，而且在提高产品产量及品质方面也具有重要作用[8-9]。
烤烟K326是云南主产烤烟品种，该品系对于维持根际土壤微生物多样性较其他品系有明显优势[10]。采用香料植物间作能够增加烤烟产品附加值[11]。土壤酶活性及微生物数量会随着植物的不同生长阶段发生相应的变化[12]。本实验采用纯培养的方法来探索蕾薹期、开花结果期、采摘期烤烟K326与5种香料植物间作模式下植物根际土细菌种群分布，探究不同间作模式下根际土细菌多样性的变化，挑选部分代表菌株对烟碱及Cr6+耐受、促生等方面进行检测，以期为进一步开发利用奠定基础。
选用云南省石林县印象山庄温室内的5种间作模式的3个生长时期(蕾薹期、开花结果期、采摘期)烤烟植物根际土，采用三点采样法，随机挑取3株中等株高、长势好、健康的烤烟植物的根际土(距地表 10-20 cm)，4 ℃保藏。选择的间作香料植物分别是香叶天竺葵(Pelargoniumgraveolens)、香茅草(Cymbopogoncitratus)、甜罗勒(Ocimumbasilicum)、迷迭香(Rosemarinusofficinalis)、薄荷(Monardadidyma)。样品信息如表 1所示。
细菌基因组DNA快速提取试剂盒，生工生物工程(上海)股份有限公司；2×TaqPCR StarMix，GenStar公司；其余常用的化学试剂均为国产AR级，阿拉丁试剂(上海)有限公司。生化培养箱，上海博讯医疗生物仪器股份有限公司；数显恒温摇床，苏州威尔实验用品有限公司；高速冷冻离心机，Eppendorf公司；超声波清洗仪，宁波新芝生物科技股份有限公司。
每个样点的3份重复土样混合均匀，常温下自然风干，采用梯度稀释法，取100 μL 10-3稀释浓度的土壤溶液涂布于不同培养基上，每种培养基做3个重复。
参照刘冰冰[13]方法进行菌株的溶磷、烟碱利用、Cr6+离子耐受、固氮、产铁载体、解淀粉等生物活性检测。
根据16S rRNA基因序列测序结果，按照EzBioCloud网站比对结果进行判断，以16S rRNA基因序列相似性98.5%作为新种的分类标准[15]，以种作为OTU分类标准，统计各样点不同OTU数目，运用R软件进行香农指数及辛普森指数计算[16]。通过对比香农指数判断纯培养分离效果。
蕾薹期、开花结果期、采摘期是烤烟植物生长的3个关键时期，不同生长时期烤烟植物的生理状态不同，微生物的菌群分布及数量会发生相应变化。具体蕾薹期、开花结果期、采摘期烤烟与5种香料植物的间作类型中，根际土及植物内生微生物会发生怎样的变化，从微生物的菌群分布判断哪种间作类型比较有利于烤烟的生长，植物生长的不同时期，微生物的菌群分布也会相应发生变化。部分分离平板、纯培养物如图 1所示。
蕾薹期烤烟植物根际土中共获得337株细菌，各间及单作类型根际土细菌分离情况[13]如表 2所示。
开花结果期各样点中共获得304株细菌，各间作及单作类型根际土细菌分离情况[13]如表 3所示。
采摘期烤烟各样点中共获得66株细菌。各间作及单作类型根际土细菌分离情况[13]如表 4所示。
不同生长时期烤烟根际土细菌共有物种除以上7个之外还有3个(3.9%)，分别为Brevibacillus、Brevundimonas、Pseudomonas。这3个类群只在3个生长时期的烤烟根际土中分离到，却未在原始土中检测到，说明这3个类群与烤烟种植关系密切。研究表明，Brevibacillus在皮革污染水中对重金属六价铬具有明显的生物还原作用[29]，能够增强烤烟抗性[30]、促进烤烟生长[31]；Brevundimonas具有极强的降解功能，可降解土壤中残存的农药及毒素维护根际健康土壤环境[32]，能够降解尼古丁减少烤烟根际及植物的尼古丁含量[33]；Pseudomonas是著名的生防菌，具有降解尼古丁特性[34]，能够促进烤烟植物生长同时增强烤烟对各种病害的抗性，降低烤烟中重金属含量[35-36]。
从与烤烟植物密切的10个属中挑选出62个不同种的代表菌株，对其相应的烟碱利用、溶磷效果、固氮作用、Cr6+耐受、产铁载体及淀粉水解作用进行检测[13]，结果如表 5所示。绝大多数菌株都能够耐受烟碱及Cr6+，对于降低烤烟植物尼古丁含量及转化Cr6+离子方面具有优势；具有较好的溶磷、产铁载体和固氮特性，对于土壤营养成分调节及促进植物生长具有一定的潜力。云南特殊的气候及地理特征，使得云南烤烟中的淀粉含量较高，影响口感。根际微生物是植物内生菌的主要来源，一些具有解淀粉特性的根际微生物可以进入植物内部，降低植物淀粉含量。
蕾薹期、开花结果期、采摘期不同种植模式下根际土细菌香农、辛普森指数计算结果如表 6所示。
微生物的多样性对于土壤质量的评价具有重要作用，微生物多样性增加能够维持健康的土壤微环境，抑制有害微生物，促进植物生长及增强植物的抗病性[8-9]。相对于其他烤烟类型来说，烤烟K326在植物品系上更有利于根际微生物多样性的维持[10]。烤烟植物的种植，由于根际分泌的化学物质的影响，使得根际微生物的种群分布及数量发生一定的变化，耕种烤烟或烤烟与香料植物间作之后，会影响土壤细菌的多样性。实验结果显示，蕾薹期香农指数变化为：W (4.079 191 7)2GAY (3.840 352 1)2GDY (3.514 562 8)2GCKY (3.497 703 4)2GBY (3.447 478 9)2GCY(3.253 409 2)2GEY (3.241 103 4)。原始土W由于在种植植物之前是统一培育的配比水肥适当的健康土壤，其细菌的多样性较高。植物根际的分泌物能够影响根际微生物的种类、数量和结构组成，对根际微生物群落结构的变化具有重要影响[37]。烤烟有非常严重的连作障碍，主要的原因是根际分泌物对土壤微生物具有一定的抑制作用，使得根际微生物的多样性减少，所以种植烤烟之后，根际细菌的多样性有所减少，选择间作的耕作方式能够缓解这种不利影响[8-9]。种植不同模式的烤烟植物之后，植物与植物的相互作用会使植物根际微环境产生变化，使原始土壤中的菌群结构发生相应变化。具体表现在与单作烤烟相比，香叶天竺葵间作烤烟及迷迭香间作烤烟微生物的多样性指数较高，说明这两种间作模式对于蕾薹期烤烟根际土细菌多样性维持效果较好；而甜罗勒间作烤烟及薄荷间作烤烟，其根际土细菌的多样性较低，可能是这两种间作模式对烤烟植物根际微生态影响较大，导致细菌的种类及数量发生较大变化。
开花结果期烤烟植物的生长状态稳定，其根际的微环境也趋于稳定，不同间作模式下烤烟根际土细菌多样性发生一定变化，香农指数变化为：3GAY (3.688 981 7)3GCKY (3.442 125 1)3GBY (3.353 155 8)3GDY (3.349 171 9)3GEY (3.306 294 5)3GCY (3.305 582 2)，结合辛普森指数来看，香茅草间作、迷迭香间作、薄荷间作及甜罗勒间作模式根际土分离到的微生物其均一性较单作烤烟要好。香茅草单作烤烟在开花结果期，其香农指数较蕾薹期有所下降。开花结果期香叶天竺葵间作烤烟的细菌香农指数最高，其次是烤烟单作、香茅草间作、迷迭香间作、薄荷间作及甜罗勒间作类型；香叶天竺葵间作、烤烟单作、香茅草间作、迷迭香间作类型烤烟根际土细菌香农指数都较蕾薹期有所降低，薄荷间作及甜罗勒间作类群根际土细菌香农指数较蕾薹期有所增加，可能开花结果期不同耕作类型根际土的微环境较蕾薹期有较大变化，使得同样培养条件下分离到的细菌多样性发生变化。
采摘期烤烟植物的生长状态欠佳，根际微环境也发生一定的变化，不利于烤烟根际微生物的生长，从采摘期单作烤烟的根际土细菌香农指数即可看出，相对于蕾薹期及开花结果期，所有间作及单作烤烟根际土细菌的多样性变差。不同的间作模式下烤烟根际土细菌的香农指数变化为：5GEY (2.857 102 8)5GBY (2.458 311 3)5GAY (2.271 868 5)5GCKY (2.210 253 6)5GCY (2.079 441 5)5GDY (0.693 147 2)。薄荷间作烤烟采摘期根际土的细菌香浓指数最高，说明其根际土细菌多样性较高，土壤生态环境维持较好。综合比较不同时期烤烟根际细菌多样性及纯培养分离结果，从微生物多样性角度分析，薄荷间作类型在缓解烤烟连作障碍方面具有优势，其次是香茅草与烤烟间作及香叶天竺葵烤烟间作类型。
用纯培养的手段从不同生长时期的各间作烤烟根际土中共获得707株细菌，分布于70个属。大量根际细菌类群的获得对后续针对筛选烤烟种植及后期加工过程中具有各种酶活作用的微生物资源具有重要意义。与烤烟种植关系密切的微生物有10个属，分别为Arthrobacter、Bacillus、Brevibacillus、Brevundimonas、Microbacterium、Nocardioides、Pseudomonas、Rhodococcus、Streptomyces和Terrabacter，具有重要的生物学特性。
蕾薹期和开花结果期分离到的细菌数量及种类较多，但是采摘期的细菌数量及种类减少明显，说明土壤中的细菌数量会随着植物生长时期的改变而发生一定变化。采摘期细菌的数量锐减，说明土壤微环境不利于细菌的生长。蕾薹期和开花结果期烤烟根际土细菌的多样性指数明显高于采摘期单作烤烟。薄荷、迷迭香、香茅草间作烤烟根际土细菌多样性在蕾薹期、开花结果期、采摘期都较高，尤其是在采摘期依然能够保持较高的细菌多样性，对于维持土壤微生物多样性、缓解烤烟连作障碍具有明显优势。
